Francesca Borghini, Francesco Giordano, Leonardo Masoni e Stefano Ferrari
ISVEA srl. Via Basilicata s/n, Poggibonsi (Siena)
Contatto e-mail: f.borghini@isvea.it
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INTRODUZIONE
La quercetina appartiene alla classe dei polifenoli, dei flavonoidi in particolare. I più abbondanti nel vino sono la quercetina, la miricetina, il kaempferolo e la isoramnetina, provenienti dalle forme glicosidate presenti nella buccia dell’acino e negli organi verdi della pianta. Successivamente, in seguito ad idrolisi nel processo di vinificazione, maturazione ed invecchiamento, i flavonoli vengono rilasciati in forme agliconiche, meno solubili. Sono composti di difesa che la vite sintetizza soprattutto in risposta a stress UV e, come gli altri fenoli, hanno importanti proprietà biologiche poiché presentano un’elevata attività antiossidante capace di prevenire la formazione di radicali liberi. Tuttavia, per quanto riguarda specificamente la quercetina, è stato osservato che essa può essere la causa di un difetto del prodotto, soprattutto nei vini a base di sangiovese, anche di alta gamma, dove può formare dei precipitati insolubili (Figura 1). La formazione dei precipitati può avvenire sia in vasca, quando il vino è ancora in cantina, sia in bottiglia; quest’ultima situazione, al pari di tutti i difetti che possono manifestarsi dopo l’imbottigliamento, determina un deprezzamento del prodotto che si risolve in un danno economico per le aziende.
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Figura 1 Deposito di quercetina osservato al microscopio ottico.
I primi documenti in cui viene citata la quercetina risalgono al 1969, a quel tempo non erano ancora noti i meccanismi della formazione del suo deposito finché, nel 1985, Somers e Ziemelis analizzarono un precipitato giallo di quercetina su vini bianchi ottenuti a partire da vendemmia meccanica. I ricercatori ipotizzarono che questo si formasse a causa del passaggio nel mosto di quercetina rutinoside, molto concentrata nelle parti verdi della vite, (considerato l’elevato numero di foglie rinvenute nel raccolto) e della successiva idrolisi di questo composto nel vino con liberazione dell‘aglicone. Negli anni successivi, le segnalazioni riguardanti la quercetina aumentarono sensibilmente, provenendo da areali molto differenti. La quercetina aglicone è un complesso instabile che nel vino tende a precipitare se in concentrazioni maggiori a 5 mg/L (Boulton, 2001). Tuttavia, può ritrovarsi in quantitativi maggiori rispetto alla sua soglia di solubilità grazie ai fenomeni di copigmentazione con gli antociani (Gutiérrez, 2005), dove è necessaria la presenza di pigmenti monomeri disposti a formare tali strutture stabili nel mezzo. L’idrolisi della quercetina glicosidata avviene in tempi relativamente lunghi (Gambuti, 2020), e nel processo di affinamento e conservazione può subire ulteriori idrolisi per mezzo di fattori quali l’apporto di ossigeno e temperatura, formando ulteriore deposito. È difficile determinare una soglia sotto la quale poter considerare un vino a basso rischio di precipitazione di quercetina poiché la varietà, la conduzione agronomica (Romboli et al, 2018), le pratiche di vinificazione e di affinamento incidono in maniera determinante sulla sua stabilità. In vini stabili, il contenuto massimo di quercetina aglicone è di circa 15 mg/L (Biondi Bartolini, 2018). Anche gli studi sulla quercetina hanno avuto uno sviluppo recente, principalmente spinto dalla ricerca di soluzioni operative in vigna e in cantina, destinate a risolvere il problema della formazione dei precipitati (Vendramin et al., 2022).
Fino ad ora i trattamenti enologici utilizzati per rimuovere la quercetina aglicone, e quindi portare il vino sotto una soglia di rischio di formazione del precipitato, sono di tipo fisico. Sono utilizzati polivinilpolipirrolidone (PVPP) e carbone vegetale attivo. Il PVPP è un prodotto enologico di sintesi, costituito da una polvere finissima, utilizzato nei processi di chiarifica, possiede caratteristiche chimiche tali da legarsi con molecole polifenoliche. Questo prodotto tuttavia non è contemplato nel protocollo di produzione del vino biologico, ed eventuali tracce comprometterebbero la classificazione del prodotto. L’uso di PVPP comporta soprattutto un depauperamento del prodotto trattato, in quanto agisce diminuendo significativamente l’intensità colorante del vino. Per quanto riguarda i carboni enologici, sono composti di origine vegetale. La loro azione si basa sul fenomeno di adsorbimento superficiale, per il quale, grazie a forze di attrazione come le forze di Van der Waals, le molecole più reattive e affini (come antociani ed etilfenoli) vengono trattenute. I carboni sono somministrati in polvere, formato granulare o in pellets, e l’utilizzo è regolamentato dal regolamento dell’Unione europea n° 606/09, dove viene espressamente dichiarato che il trattamento con carbone per uso enologico è autorizzato soltanto per i seguenti prodotti: mosto e il vino nuovo ancora in fermentazione, mosto di uve concentrato rettificato, vini bianchi. Il suo impiego è ammesso per migliorare le caratteristiche di alcuni mosti alterati da attacchi fungini come l’oidio e la botrite, eliminare eventuali contaminanti (ad esempio ocratossina A), e migliorare il colore nel caso dei vini bianchi. L’aggiunta di carbone deodorante deve essere associato necessariamente ad una successiva filtrazione a membrana. Secondo il regolamento europeo 934/19, è possibile usare il carbone decolorante solo su vini giovani perciò fino alla fine dell’anno solare della vendemmia. Tuttavia l’utilizzo di questi prodotti può comportare un abbassamento di alcune caratteristiche organolettiche, ed è quindi sempre opportuno, quando impiegati, valutare la minima dose necessaria. Per le aziende biologiche che incontrano il problema di precipitazione della quercetina, non è semplice affrontare e trovare una soluzione al fine della sua stabilizzazione. Una possibile strategia per affrontare il problema della formazione dei precipitati a base di quercetina, può essere quella di creare condizioni favorevoli all’idrolisi precoce del glucoside, e rimuovere ciò che si forma sul fondo del recipiente prima dell’imbottigliamento. Tale strategia può essere messa in atto con tecniche di ossigenazione praticabili a partire dai travasi che, intensificando l’apporto di O2 al vino, riducono drasticamente la frazione aglicone e in parte il glucoside, favorendone la precipitazione. In alcune prove effettuate con l’apporto di circa 6 mg/L di O2, viene ridotto il tenore in quercetina aglicone fino al 50% (Gambuti, 2020). Fra le pratiche enologiche che possono favorire la stabilizzazione della quercetina troviamo:
a) l’utilizzo di enzimi o lieviti con attività glicosidasica per favorire l’idrolisi precoce della quercetina glicosidata;
b) evitare eventuali aggiunte in tannini nelle fasi iniziali di vinificazione, in quanto potrebbero complessare gli antociani disposti a copigmentarsi con la quercetina;
c) l’uso di barrique nuove che consentono un elevato scambio di ossigeno, garantendo un buon rapporto volume/superficie di contatto, che potrebbe incentivare la precipitazione dell’aglicone durante la maturazione;
d) l’esecuzione di cicli caldo-freddo inducono l’instabilità di pigmenti e dei polimeri fenolici allo stato colloidale di cui fa parte anche la quercetina. È da valutare l’impatto della pratica sulla qualità sensoriale del vino;
e) il mantenimento di solforosa a livelli minimi, può consentire di avere più antociani monomeri disponibili a legarsi con la quercetina aglicone, rendendola stabile nel mezzo grazie ai fenomeni di copigmentazione;
f) il ricorso alle pratiche di assemblaggio ove consentito, con vini a minor contenuto di quercetina o con elevata carica polifenolica potrebbe attenuare il rischio di precipitazione;
g) l’aggiunta nel caso di vini a medio rischio di mannoproteine e tannini, in quanto colloidi protettori interagiscono mostrando una lieve opposizione alla precipitazione della quercetina in eccesso (QUE-STAB, 2018).
In seno al Progetto Vintegro (Integrità e stabilità del vino toscano), finanziato dalla Regione Toscana nell’ambito del Programma di Sviluppo Rurale 2014-2020 – bando relativo al “Sostegno per l’attuazione dei Piani Strategici e la costituzione e gestione dei Gruppi Operativi del Partenariato Europeo per l’Innovazione in materia di produttività e sostenibilità dell’agricoltura (PEI-AGRI) - sono state effettuate alcune prove in laboratorio e di cantina al fine di verificare quali condizioni ed eventuali prodotti enologici potessero influire sulla stabilità della quercetina nel vino.
Nell’anno 2020 presso il laboratorio ISVEA è stata condotta un’accurata profilazione analitica di una serie di vini sangiovese di annate diverse (2017-2019), per cercare di indagare le relazioni della quercetina con le altre componenti della matrice; contemporaneamente sono state condotte delle prove di abbattimento del contenuto in quercetina (aglicone e glicoside). Per la sperimentazione sono stati utilizzati due vini con un contenuto rilevante di quercetina, i quali sono stati ripartiti in più campioni (193 prove totali) e trattati con diverse tipologie di prodotti enologici commerciali (chiarificanti, derivati di lievito, enzimi, polifenoli ed altri prodotti), simulando pratiche di cantina e alcuni metodi di condizionamento. Trascorso il tempo di stoccaggio i campioni sono stati analizzati mostrando delle differenze dovute al trattamento eseguito. Nel 2021, sia in laboratorio che su scala di cantina, sono stati testati prodotti immessi in commercio applicabili anche alle produzioni biologiche.
MATERIALE E METODI
Vini
Per lo screening sono stati analizzati oltre 50 campioni di Sangiovese di diverse annate 2017, 2018 e 2019.
Per condurre la sperimentazione, sono stati sottoposti alle prove due vini in fase di affinamento non ancora imbottigliati, prodotti con uve Sangiovese in purezza, con una concentrazione di quercetina glucoside di rispettivamente 31 mg/L e 26 mg/L e di quercetina aglicone 11 mg/L e 9 mg/L. I due vini utilizzati, hanno mostrato similitudini anche dal punto di vista del contenuto totale di polifenoli. I due vini sono stati sottoposti a test che consistevano in simulazioni di pratiche enologiche e aggiunte di prodotti enologici. I vini sono stati analizzati dopo 14 giorni dal trattamento (Figura 2).
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Figura 2. Schema dei principali passaggi della sperimentazione
Il campione utilizzato nel 2021 presentava invece concentrazioni di quercetina aglicone di 10 mg/L, 15 mg/L di glicoside e 32 mg/L di quercetina glucuronide.
Metodi di analisi
Su tutti i campioni è stato effettuato uno screening generale comprensivo delle analisi di controllo classiche: acidità totale, acidità volatile e pH, intensità e tonalità di colore sono stati determinati secondo i metodi OIV (OIV-MA-AS313-01, OIV-MA-AS313-02 e OIV-MA-AS313-15, OIV MA-AS2-07B rispettivamente). I polifenoli sono stati analizzati misurando le assorbanze a diverse lunghezze d’onda, ricavando: polifenoli totali (mg/L di acido gallico); tannini totali (g/L); antociani totali (mg/L); e in unità di assorbanza (U.A): antociani liberi, antociani totali, complessi antociani-tannini, fenoli totali.
Le analisi relative alla ricerca della quercetina sono state eseguite con il metodo della cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC, Skoog D.A., Leary J.J., 1995). Sono stati utilizzati due strumenti con diversi rilevatori per ottenere analisi distinte, ovvero con il rilevatore UV-VIS abbiamo ricavato i primi dati relativi alla quercetina glucoside e aglicone, mentre con lo spettrometro di massa HRMS sono stati approfonditi i campioni ritenuti più interessanti in base alle variazioni significative di quercetina, analizzando quindi le frazioni legate all’acido glucuronico, galattosio e rutinosio.
Il campione da analizzare è prima filtrato a 0.45 µm.
Prodotti enologici
Le classi dei prodotti utilizzati per le prove sono:
Piano sperimentale
Il vino è stato ripartito in bottiglie da 250 mL trasparenti con tappo in plastica e precedentemente numerate, dove ad ogni numero corrisponde un particolare trattamento o aggiunta. In tutto sono stati realizzati 193 campioni. Prima della chiusura della bottiglia sono stati introdotti i vari prodotti, sciolti preventivamente in 10 mL di acqua distillata con l’ausilio del vortex, grazie al quale è stato possibile miscelare al meglio la soluzione da aggiungere. Alcuni campioni sono stati aggiunti con un’aliquota pari al 50% di un altro vino rosso o bianco a basso contenuto di quercetina. Dopo l’aggiunta dei prodotti enologici, le bottiglie sono state sottoposte a trattamenti differenti:
Temperatura ambiente (20°C, al riparo dalla luce e sbalzi termici ambientali);
Condizionamento a freddo (-4°C, stoccate in frigorifero);
Condizionamento a caldo (30°C, in camere climatiche senza e con luce UV continua);
Rimontaggi all’aria (20°C, al riparo dalla luce e sbalzi termici ambientali);
Rimontaggi al chiuso (20°C, al riparo dalla luce e sbalzi termici ambientali);
Aggiunta di 20 g/hL di bentonite (20°C, al riparo dalla luce e sbalzi termici ambientali).
RISULTATI E DISCUSSIONE
SCREENING VINI
I risultati della profilazione dei 50 campioni di sangiovese sono stati analizzati con tecniche statistiche di tipo multivariato e sono riassunti nella figura 3. In funzione di tutti i parametri analizzati si nota una chiara clusterizzazione dei campioni: quelli del 2017 si trovano nel quadrante in alto a sinistra e sono caratterizzati da alte concentrazioni di quercetina glicosidata e glucuronide, oltre a essere ricchi di tannini; i vini del 2019 invece, che si trovano nel quadrante opposto, presentano livelli elevati di quercetina aglicone.
L’analisi delle correlazioni (dati non mostrati) ha confermato (QUE-STAB, 2018) delle correlazioni significative e positive tra quercetina aglicone e antociani e tra forme legate della stessa con i tannini. In base a tali risultati è stato elaborato un indice che valuti il rischio di precipitazione della quercetina (Indice di rischio QUESTAB, tabella 1), per calcolare il quale è necessario determinare non solo il contenuto di quercetina aglicone e glicosidata, ma anche i tannini e gli antociani presenti nel campione.
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Figura 3 Analisi delle componenti principali (PCA) dei campioni di sangiovese 2017-2019.
Tabella 1 Indice di rischio QUESTAB.
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L’indice è stato validato nel corso del secondo anno di progetto analizzando non solo tutti i campioni previsti dal progetto, ma anche oltre 800 campioni arrivati in laboratorio.
Profilo delle quercetine dei vini
Nelle figure 4 e 5 sono mostrati i risultati ottenuti nelle prove. I tenori di quercetina aglicone di tutti i campioni (Figura 4), mostrano un andamento piuttosto variabile, infatti, considerando che la retta tratteggiata indica il contenuto del tal quale, in alcune prove la concentrazione diminuisce notevolmente, in altre subisce un notevole aumento.
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Figura 4 Tenore di quercetina aglicone in tutte le prove effettuate.
Il contenuto di quercetina glucoside (Figura 5), mostra delle diminuzioni in corrispondenza delle variazioni di aglicone. Facendo riferimento alla retta tratteggiata che indica il contenuto di quercetina glucoside del tal quale, questa frazione viene solo ridotta, senza essere mai completamente eliminata.
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Figura 5 Contenuto di quercetina glucoside in tutte le prove effettuate.
Solo i campioni che hanno mostrato differenze significative nella concentrazione di quercetina e quercetina glucoside rispetto al vino di partenza sono stati sottoposti ad analisi più approfondite tramite HPLC-HRMS. Le analisi in alta risoluzione hanno permesso lo studio delle varie frazioni di quercetina (quercetina aglicone; quercetina glucoside, quercetina galattoside; quercetina glucuronide e quercetina rutinoside). Di tutti i prodotti a base di enzima, le β-glucanasi non hanno avuto alcun effetto, mentre alcuni pectolitici e le α e β-glicosidasi hanno mostrato variazioni significative. In figura 6 sono riportati i tenori di quercetina nelle tre forme (aglicone, glucoside e glucuronide) del tal quale e dei campioni con aggiunta enzimatica, ovvero enzimi pectolitici (Ep1= N.127; Ep2= N.129), enzimi α e β-glicosidasi (Eg1= N.50; Eg2= N.188) ed uno misto di enzimi pectolitici e α e β-glicosidasi (Ep+Eg= N.134). Si nota un incremento della quercetina aglicone, con corrispondente diminuzione della frazione glucoside e soprattutto della glucuronide.
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Figura 6 Contenuto (in mg/mL) in quercetina dei campioni trattati con enzimi pectolitici (Ep1, Ep2), α e β-glicosidasi (Eg1, Eg2) ed uno misto con entrambe le tipologie (Ep+Eg).
Nel 2021 è stato testato sia in laboratorio che su scala di cantina un prodotto enzimatico applicabile in regime biologico. La Figura 7 riporta i risultati della sperimentazione condotta in cantina, dove la vasca trattata è stata campionata con cadenza quindicinale. Dopo un mese, la concentrazione di quercetina legata (all’acido glucuronico e al glucosio) era notevolmente abbattuta, contemporaneamente è stato osservato un grosso incremento della frazione aglicone.
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Figura 7 Contenuto (in mg/mL) in quercetina aglicone e legata dei campioni trattati con enzima pectolitico in cantina.
Considerando i chiarificanti, le oscillazioni dei tenori di quercetina sono rilevate soprattutto nei trattamenti a base di PVPP (N.22) e di carboni vegetali (Carb 1= N.114; Carb 2= N.126) che hanno determinato una notevole riduzione dell’aglicone, confermando la loro azione già nota (Figura 8). Il secondo carbone in particolare (Carb 2), ha abbattuto completamente la concentrazione di aglicone.
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Figura 8 Contenuto di quercetina nei campioni con chiarificanti quali PVPP, e carboni vegetali (Carb 1, Carb 2).
In merito alle prove effettuate e ai risultati ottenuti, alcuni trattamenti e aggiunte si sono rivelati efficaci nel provocare variazioni del contenuto in quercetina. Il taglio con vini a minor contenuto di quercetina, è stato l’unico trattamento che ha mostrato una diminuzione della frazione aglicone e glucoside. È possibile considerare tale pratica come efficace al fine di ridurre e stabilizzare la quercetina. Tra i prodotti appartenenti al gruppo degli enzimi, alcuni pectolitici ed α e β-glicosidasici hanno avuto un effetto idrolizzante sulle concentrazioni di quercetina glucoside e soprattutto glucuronide, incrementando il tenore della frazione aglicone. Vengono confermate le azioni di PVPP e carboni vegetali nella riduzione di aglicone, tra cui un carbone in particolare, si è rivelato più incisivo abbattendo completamente la sua concentrazione. Nonostante l’elevata efficienza di questi chiarificanti, non è da sottovalutare l’effetto sottrattivo dal punto di vista organolettico, incidendo su colore, struttura e aromi, dunque potenzialmente sulla qualità. Al fine della stabilizzazione, occorre valutare il contenuto delle varie forme di quercetina: nel caso di un elevato tenore in forme legate, l’aggiunta di enzimi ne provoca l’idrolisi, favorendo la liberazione di aglicone. Solo successivamente sarà possibile eliminare la frazione libera in eccesso con gli opportuni chiarificanti, portando il suo contenuto sotto una soglia di rischio. Oltre alla frazione aglicone e glucoside, il contenuto in quercetina glucuronide, rappresenta un potenziale rischio di instabilità, poiché nelle fasi di affinamento e invecchiamento, potrebbe comportare un seppur lento incremento di aglicone e successiva precipitazione dovuta alla sua idrolisi.
BIBLIOGRAFIA
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